如何構(gòu)建和提升顯微鏡

許多生物科學(xué)家都將他們的顯微鏡與照相機相連以進行記錄并分析圖像。如今的顯微照相機，已經(jīng)由電傳感器取代了膠片。其中最早的一種傳感器是電荷耦合元件，它利用像素矩陣捕獲光線并將其轉(zhuǎn)換為電信號。許多制造商仍在使用這種類型的傳感器，它們是極其可靠的。

成本較低的互補金屬氧化半導(dǎo)體則來源于集成電路產(chǎn)業(yè)。這種傳感器也將光轉(zhuǎn)換為電信號，但它需要在傳感器上有更多的電路，這樣就占用了感應(yīng)的空間，因此這項技術(shù)通常比不上CCD的光線敏感度。然而，由于像素是集中檢測而非單個檢測，CMOS傳感器可以得到比CCD傳感器更快的幀率。CMOS的新版本——科學(xué)CMOS，通過在維持速度的情況下提供更強的敏感性，解決了該技術(shù)的缺陷。

然而，不同的應(yīng)用常常決定了照相機哪一種獨特的性能是必要的。“如果你在構(gòu)建一種簡單的顯微鏡，只為拍攝一個被H&E染色的樣品照片，你不需要過分奢侈的照相機。”如果你需要更高的成像速率或者檢測弱熒光信號的能力，Richardson說，“你可能會從一臺價值2000美元的照相機升級到一臺價值20000或30000美元的照相機。”前者可能是一個高端消費型CCD照相機，而后者則可能是個sCMOS照相機。

制造商也在繼續(xù)通過各種感應(yīng)器在顯微照相機中謀求新的發(fā)展。

科學(xué)家在為顯微鏡配備相機時，可以從其他裝載了16毫米對角線CCD的選擇中做決定，例如由加拿大不列顛哥倫比亞省薩里市QImaging公司制造的Retiga 6000。QImaging的產(chǎn)品經(jīng)理Chris Ryan介紹，這一照相機“的服務(wù)對象是那些想要掃描整張載玻片或同時監(jiān)測大群細胞（如高容量篩選）的客戶。”

例如，在熒光成像中，科學(xué)家考慮的是敏感性和分辨性，Ryan說。敏感性決定著可以檢測出的最弱的熒光信號，而分辨性則顯示了圖像可以識別的最細微的特征。“那些特征是照相機與物鏡的組合。”Ryan說。

在某些情況下，生物科學(xué)家可能傾向于具有一系列特征的照相機。若是如此，他們可能會選擇sCMOS的照相機。例如，愛爾蘭貝爾法斯特Andor技術(shù)公司的生命科學(xué)應(yīng)用專家Orla Hanrahan提到了Andor的Zyla 4.2系統(tǒng)。“這臺儀器可以提供敏感性、速度和廣闊的視野，就像一臺全能的照相機。”Hanrahan說。

然而，在低光成像中，研究者可能更傾向于電子倍增電荷偶聯(lián)的照相機。EMCCD包括了能將常規(guī)CCD的輸出結(jié)果倍增的電荷設(shè)備。因此，EMCCD可以檢測微弱的信號。例如，美國亞利桑那州圖森Photometrics公司的Evolve 512 Delta系統(tǒng)使用的就是EMCCD傳感器。然而，Photometrics的產(chǎn)品經(jīng)理Rachit Mohindra卻指出了其中的缺點：“在如此低光水平下工作，EMCCD照相機使用的傳感器像素更大，會在給定的范圍內(nèi)收集更多的光，因此你看不到更精準的細節(jié)。”

 

如今的生物科學(xué)家經(jīng)常對活體細胞進行成像。傳統(tǒng)上，科學(xué)家大多在觀測死的細胞，這些細胞的制作過程會使樣品非常健壯，能夠在不受特殊關(guān)照的情況下保存若干年。與之相比，活細胞必須得到精心培養(yǎng)以使它們保持活性。美國加州卡爾斯巴德的生命科技公司高級研發(fā)經(jīng)理Michael O'Grady說：“為了得到清晰的圖像，你需要保持細胞的健康。”

為此，科學(xué)家必須在觀測活細胞時維持特殊的環(huán)境條件。為了決定哪個設(shè)備為特殊的應(yīng)用提供最優(yōu)的條件，科學(xué)家可以咨詢專家，例如美國伊利諾伊州維斯塔蒙特市McCrone顯微鏡及配件公司的儀器銷售部總裁與主任Jeffrey D. McGinn。他說：“當有人聯(lián)系到我們，我們會進行一些需求評估的問卷，例如咨詢客戶想要觀測的樣品類型，以及樣品是否需要置于某種特定環(huán)境中。”因此，他可能建議配置一個溫度控制的平臺系統(tǒng)，如英國薩里市Linkam科學(xué)儀器公司所提供的平臺。這些平臺能夠保持樣品在-196℃~1，500℃的溫度范圍。其中一個應(yīng)用就需要加熱，McGinn指向制藥業(yè)。他說：“當你加熱藥物產(chǎn)品時，可能會經(jīng)過多態(tài)的轉(zhuǎn)變。其中一些會有不同的反應(yīng)。”所以藥學(xué)科學(xué)家可能要將樣品暴露在一系列的溫度范圍中，以尋找轉(zhuǎn)變點。在另一個例子中，研究者可能僅需要在成像實驗中讓細胞樣品維持在體溫環(huán)境中。

一些應(yīng)用甚至需要更高水平的環(huán)境控制，科學(xué)家可以利用由先進顯微鏡公司提供的平臺式孵育器獲得，其中包括一個可控環(huán)境的培養(yǎng)室。“這一設(shè)備本質(zhì)上是EVOS熒光顯微鏡的插件。”生命科技公司產(chǎn)品經(jīng)理Hans Beernink說，“它被整合到顯微鏡中，由軟件所控制。”它可以控制其溫度、濕度、甚至是氣體，如氧氣。

 

除了要保持細胞的健康狀態(tài)，活細胞成像也帶來了其他獨特的挑戰(zhàn)。一些科學(xué)家必須克服光學(xué)上的障礙，另一些則偏向于機械問題。

獨特的光學(xué)因子開始在活細胞成像中起作用。由于物鏡最初是為固定樣品所設(shè)計的，與活細胞相比具有不同的光學(xué)特性，這就造成了對于新的顯微鏡解決方法的需求。加拿大安大略省列治文山的奧林巴斯加拿大公司科學(xué)儀器部市場經(jīng)理Andrew Millar說：“我們有機硅浸漬的物鏡就是為成像活細胞所設(shè)計的。”他接著說，“當使用有機硅浸沒光學(xué)后，從活細胞收集的成像更加明亮，分辨率更高。”這些物鏡可以達到30倍、40倍和60倍，可以配在任何奧林巴斯的顯微鏡上。因為有機硅浸漬介質(zhì)的折射參數(shù)非常類似于活細胞的折射參數(shù)，它們提高了成像的質(zhì)量。

活細胞成像技術(shù)包含了廣泛的應(yīng)用，其中有些卻十分特殊。例如，在電生理學(xué)領(lǐng)域，一旦你將玻璃電極插入所需的神經(jīng)元中，你不希望任何東西碰到它，擔(dān)心會突然地終止你的記錄。但是如果你想要看一下旁邊的物體，甚至是放入第二個電極？你不能夠移動顯微鏡載物臺，但是有些技術(shù)卻可以讓你將物鏡重新定位，如佛蒙特州威利斯頓市MBF生物科技公司的徑向移動物鏡。“它能夠使物鏡在x和y方向上移動。”該公司總裁 Jack Glaser介紹，“樣品固定不動，通過物鏡移動來掃描不同的點。”Glaser接著說，RMO能夠配合大部分的顯微鏡和物鏡。“你只需要轉(zhuǎn)動鏡頭轉(zhuǎn)輪，換成RMO，旋緊旋鈕，就能夠使用了。”Glaser解釋道。RMO配備的控制盒能夠讓計算機移動物鏡。

 

無論科學(xué)家是在觀測活細胞或固定樣品，控制照明對于顯微實驗來說都是一個重要的方面，特別是對于如今需要多重激光來點亮樣品中不同熒光標記的成像技術(shù)。“人們對他們的實驗有自身的偏好和需求。”總部設(shè)在紐約州梅爾維爾的尼康儀器公司美洲市場和產(chǎn)品部總經(jīng)理Stephen T. Ross說。

為了幫助他們實現(xiàn)這些需求，尼康為自己的Ti倒置顯微鏡研發(fā)了新的組件。例如，尼康的LU-N激光單元能夠裝載多達8種激光，范圍是356~756納米。“這些激光單元也能夠提供多達7種不同的輸出，能夠與多種儀器相連，如熒光成像的光激活系統(tǒng)。”Ross說，“此外，這是個固態(tài)的激光系統(tǒng)，當它從盒子中取出時，不需要反射鏡或者調(diào)解裝置。”

尼康研發(fā)的L-Apps系統(tǒng)組件與LU-N系統(tǒng)一并推出。“這些應(yīng)用組件能夠通過我們的軟件與LU-N進行協(xié)同工作。” Ross說，“這就可以接受復(fù)雜的實驗，使得它們能夠為不同專業(yè)水平的人們所使用。”當照亮活細胞時，激光會損傷樣品。因此對于照明的控制就派上了用場。

為了真正減輕熒光成像中激光照明的潛在損傷，科學(xué)家可以使用雙光子顯微鏡。它通過一次性利用兩個光子激活熒光分子，來降低光對于樣品的影響，每個只攜帶一個光子能量需求的約一半。為了進一步減少組織損傷，科學(xué)家可以使用能夠造成脈沖非常短的激光，這也能夠減少樣品應(yīng)用的能量。如今這種成像最快的激光能夠在飛秒的范圍中產(chǎn)生脈沖。

當問及制造大多數(shù)生命科學(xué)實驗室可以使用的飛秒激光時，奧地利維也納Femtolasers Produktions公司的總裁Andreas Stingl提到了三件事：易于使用、一萬小時的生命周期和強大的構(gòu)造。他說：“目前，能夠在80兆赫的重復(fù)率下操作、并能在100飛秒的范圍內(nèi)傳送脈沖的可調(diào)節(jié)鈦藍寶石振蕩器，是雙光子顯微鏡使用的標準資源。”除了造成傷害較少之外，飛秒脈沖能夠比長脈沖穿透更深的組織。Stingl舉例表示，“在相同的平均功率下，Sub-20飛秒脈沖比120飛秒脈沖多出160%的穿透深度。”

這種“分鐘—飛秒”的轉(zhuǎn)變對于成像的影響，揭示了當今顯微鏡技術(shù)的精確性。但是也不應(yīng)過度關(guān)注如此微小的參數(shù)，以至于忽略了將所有正確的顯微鏡組件搭配在一起的整體需求。每一部分都很重要，它們之間的相互作用也是如此。這些都必須整合進一個系統(tǒng)，以滿足每個科學(xué)家的需求。