顯微鏡數(shù)字化讓病理學精確診斷

新問題層出不窮

病理學前所未有的發(fā)展也提出了許多新的問題讓我們思考。組織結(jié)構(gòu)和免疫組織化學表型相同的肺腺癌存在著不同的驅(qū)動基因，而普通型乳腺癌則具有不同的分子變化譜，東西方肝細胞癌則具有不同的病因以及不同的分子學發(fā)病通路。非常令人迷惑的是EwSRl基因。Ewing／PNET肉瘤是EWSRl基因與近十個不同基因融合的結(jié)果，但EwsRl基因與其他基因融合則可發(fā)生多種組織形態(tài)的軟組織腫瘤；而同樣的EwSRl．ATF融合則可出現(xiàn)在血管瘤樣纖維組織細胞瘤和部分透明細胞肉瘤。即同一腫瘤可能由不同分子介導，而不同腫瘤可能有同一分子改變。這些事實提示腫瘤細胞分化方向與途徑(即組織發(fā)生學或表型特征)可能與腫瘤驅(qū)動基因介導的過程是相互相對獨立的事件。同時，腫瘤靶向治療的實踐表明，我們更應(yīng)該注意那些同類腫瘤中僅在部分腫瘤表達和突變的分子，在傳統(tǒng)的分析中由于統(tǒng)計學處理這類分子改變難以達到有統(tǒng)計學意義而通常被忽視。過去我們一般注意分子改變的普遍性，例如，在結(jié)腸癌或肺癌中只注意那些普遍存在的過表達的基因，現(xiàn)在看來今后的研究應(yīng)當更加注意對觀測指標分析的標準即閾值、終點的設(shè)置。這些問題也同樣存在于現(xiàn)在對腫瘤預(yù)后因子的研究中，目前多數(shù)研究仍集中于確定具有普遍意義的預(yù)后預(yù)測因子，如果考慮到表型與分子事件之間的相對獨立性，確定具有普遍意義的預(yù)后預(yù)測因子不一定具有可行性。事實上，目前發(fā)現(xiàn)的預(yù)后因子多數(shù)僅反應(yīng)某些類型的預(yù)后意義就不難理解：如N-myc擴增僅僅反映部分神經(jīng)母細胞瘤的預(yù)后。所以，預(yù)后因子可能與驅(qū)動基因有關(guān)，也具有類型的特異性。

對腫瘤的異質(zhì)性的認識需要不斷深化。過去病理學界對腫瘤異質(zhì)性的關(guān)注只是著重于表型的異質(zhì)性(分化與結(jié)構(gòu)，或生物學行為)，而腫瘤靶向治療實踐顯示這種表型的異質(zhì)性似乎并不十分重要，而分子層面的異質(zhì)性可能更值得探討。那么分子的異質(zhì)性性又應(yīng)該從哪些方面考察呢？可能應(yīng)考慮：(1)驅(qū)動基因突變方式：不同的突變方式與下游的活化狀態(tài)，以及藥物敏感性的差異；(2)驅(qū)動基因介導的信號通路基因改變；(3)p53、RB、PTEN、BRCAl、錯配修復(fù)(MMR)等腫瘤抑制基因的狀態(tài)；(4)腫瘤細胞遺傳不穩(wěn)定性：如基因組隨機性改變，尤其是近年來新發(fā)現(xiàn)的染色體碎裂(chromothripsis)所引起的基因組異常；(5)與腫瘤微環(huán)境、代謝相關(guān)的調(diào)節(jié)機制；(6)在靶向治療過程中檢測到的“新發(fā)”突變，究竟確為新發(fā)，還是腫瘤異質(zhì)性的結(jié)果(原先主宰腫瘤的優(yōu)勢克隆被抑制后，耐藥克隆轉(zhuǎn)變成主宰克隆)，還有我們尚未發(fā)現(xiàn)的因素。另外，常見的p53、RB、PrEN等腫瘤抑制基因以及RAS、myc癌基因涉及眾多腫瘤，具有普遍性，且相關(guān)作用途徑已經(jīng)大致清晰，但目前仍缺乏作為靶點的有效干預(yù)手段。腫瘤增殖特性評估尚缺乏更好的指標，尤其是部分高度惡性腫瘤其Ki-67陽性指數(shù)不高，許多上皮性癌Ki-67的參考意義不大，表明對腫瘤細胞增殖特點的認識仍然十分局限。此外，腫瘤靶向治療的實踐也挑戰(zhàn)我們的許多傳統(tǒng)觀念。其中，值得注意的是有關(guān)腫瘤惡性度的問題。這些年因為臨床對部分腫瘤有了有效的治療方法，尤其是乳腺癌、肺腺癌、黑色素瘤等惡性度較高的腫瘤，表明腫瘤的惡性度也具有相對性，是否具有有效的治療手段，較單純的惡性度判斷更為重要。

原發(fā)腫瘤與其轉(zhuǎn)移瘤的平行發(fā)生理論值得關(guān)注。腫瘤靶向治療顯示針對原發(fā)癌的有效藥物對轉(zhuǎn)移癌也同樣有效，表明至少部分轉(zhuǎn)移癌的分子特性依然保持著原發(fā)癌的特征。似乎轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療并非像過去認為的那樣困難。同時值得關(guān)注的是近年來腫瘤轉(zhuǎn)移的研究進展，如腫瘤干細胞理論，轉(zhuǎn)移與腫瘤發(fā)生的關(guān)系，即腫瘤轉(zhuǎn)移可能伴隨著其形成的全過程，這些對腫瘤病理檢查、轉(zhuǎn)移危險度、治療效果判斷、標志物的篩選均可能帶來影響。對于這些問題我們目前尚無確切的答案，但發(fā)現(xiàn)這些問題則是解決的開端。

 

 

從圖像分析軟件到安裝在手機上的無透鏡顯微鏡，計算創(chuàng)新及其新的工具正在給病理學家們提供更清晰、更富含信息的圖像。

 

然而，病理學依然是一門頑固的模擬的和定性的科學。經(jīng)驗豐富的病理學家的主要工具是載玻片——200多年幾乎沒有改變的復(fù)式顯微鏡外加一雙眼睛。耶魯醫(yī)學院病理學家戴維·里姆（David Rimm）說：“病理學家的大多數(shù)醫(yī)療決策是根據(jù)形態(tài)學定義的。”也就是顯微鏡下細胞和組織的結(jié)構(gòu)細節(jié)。

當然，方法的陳舊決不是放棄它的原因。但是，數(shù)字式病理學倡導者們擔憂的是（決策）不一致會帶來假陰性或誤診。比如，在鑒定罕見腫瘤時，有經(jīng)驗的病理學家往往比年輕人做得好，但是，彼此經(jīng)常出現(xiàn)判斷不一致，尤其是對同一個樣品的不同評估，這是矛盾的。

數(shù)字式病理學早期提倡者、俄亥俄州立大學的生物醫(yī)學信息學家梅廷·居爾坎（Metin Gurcan）認為，臨床數(shù)字化的障礙在于圖像的大小和其處理過程復(fù)雜性。首先，要將活檢組織切成多個部分并放在多個載玻片上，一個載玻片在顯微鏡下放大得到的數(shù)字式圖像大約有100億個像素，需要30千兆字節(jié)的內(nèi)存。例如，典型的前列腺穿刺活檢使用20多張載玻片，需要大約600千兆字節(jié)。

接著，便是大量的數(shù)據(jù)等待著病理學家的掃描或軟件的篩選。居爾坎說：“在這些圖像中解讀細胞數(shù)目和類型是令人難以置信的。”然而，一種與這種復(fù)雜性打交道的方法就是通過軟件來識別和解讀，就像人所做的那樣，而且更快速、一致。

正如人們通過學習來掌握知識那樣，軟件也可以。2011年，哈佛醫(yī)學院的病理學家安德魯·貝克（Andrew Beck）建立了一種稱為C-Path的學習軟件，結(jié)合248名患者的乳腺癌活檢圖像和生存資料，該軟件學習后可以給乳腺癌患者進行評分和預(yù)測其存活率。

在顯微鏡下觀察活檢組織，病理學家主要憑借癌細胞三個特有的特征來甄別腫瘤的攻擊性：細胞核形狀是否異常？細胞是否正在分裂？細胞彼此是否正常連接或分離？病理學家們將這些特征逐項量化后以此確定腫瘤級別及描述其攻擊性如何。

而C-Path系統(tǒng)的工作原理是，將圖像分割成“超像素”小區(qū)域，在每個超像素內(nèi)鑒別細胞核和細胞質(zhì)，并與鄰近的超像素比對――顏色、紋理、大小和外形。對于乳腺癌，這種比對分析產(chǎn)生的特征與兩種事物相關(guān)：樣品的全結(jié)構(gòu)和其精細比例細節(jié)，例如，癌細胞和正常細胞的細胞核之間的平均距離。

最后，C-Path得到的6 642個特征結(jié)構(gòu)，在描述癌細胞自身的同時，還包括周圍基質(zhì)的連接組織。事實上，基質(zhì)形態(tài)學比單獨的癌癥形態(tài)學具有更好的存活預(yù)測因子：基質(zhì)區(qū)域形態(tài)一致與良好的預(yù)后有聯(lián)系，而被上皮細胞浸潤的基質(zhì)，則指示程度較高的進展性癌癥?；趯?shù)千個特征結(jié)構(gòu)的分析，C-Path做出了比標準的病理學分析更準確的患者存活率分析。貝克現(xiàn)在在更廣范圍樣品中訓練他的軟件，包括全玻片圖像和正常乳腺組織樣品。

 

有可能的是，病理學家也會尋找到由C-Path計算出的數(shù)千特征結(jié)構(gòu)中的一些特征，但卻難以用詞語來表述它們。比如，將一例確診的腫瘤和在一幅照片中識別出你叔叔的經(jīng)歷進行比對。你不能確切地說清楚他是你叔叔――是他的鼻子、眼睛還是衣服？只知道這就是他。但是，計算機卻可以量化分析一幅圖像的特征，并且可以重復(fù)。

也有人認為，作為第二雙犀利的眼睛，軟件的正確用途應(yīng)該是幫助醫(yī)生從海量數(shù)據(jù)中尋找或?qū)δ繕宋镞M行分類，以此減輕他們的工作量。安阿伯市密歇根大學的病理信息學專家尤里西斯·巴利斯（Ulysses Balis）正在開發(fā)一種稱為SVIQ的通用視覺搜索程序。

為了對SVIQ進行實證，巴利斯通過不同角度對大腸腺癌切片的數(shù)字式圖像進行放大和縮小，如果他發(fā)現(xiàn)有趣的東西――比如一個看似正在分裂的細胞――并想在圖像中搜索其他有相似特征的結(jié)構(gòu)，就點擊“掃描”按鈕，軟件隨即將圖像中相似的部分亮化，前后花費大約10秒時間。他說：“這可能是最簡單的二維圖像搜索結(jié)構(gòu)，是一個良好的應(yīng)急工具。”

與C-Path主要做診斷決策不同，SVIQ軟件可以幫助病理學家在數(shù)字式病理學圖像中發(fā)現(xiàn)興趣位點。美國國立癌癥研究所（NCI）從事病理信息學研究的賈森·希普（Jason Hipp）認為，病理學家們所能做的是逐個對視野中一些正在分裂的細胞進行計數(shù)，不同的是，SVIQ可以對整個組織切片內(nèi)每個分裂細胞進行計數(shù)。因此，SVIQ在提高病理學家工作效率的同時，并提供更多的形態(tài)學數(shù)據(jù)。

希普的目標之一是將SVIQ整合進癌癥患者的篩選過程中。通常這要從發(fā)現(xiàn)癌癥患者的遺傳學試驗開始，對于那些分散在人體內(nèi)的腫瘤，包括活檢組織在內(nèi)，一時很難發(fā)現(xiàn)足夠的癌組織進行遺傳學篩選。一般情況下，從取出活檢組織到對其癌樣部分鑒定和染色，過程大約為25分鐘時間。通過SVIQ軟件，病理學家從發(fā)現(xiàn)圖像中某個區(qū)域的癌細胞，到亮化與其特征相似的其他結(jié)構(gòu)部分，過程大約為5分鐘。

在倫敦癌癥研究所，生物信息學研究人員袁茵茵（Yinyin Yuan，音譯）正在將腫瘤中所有細胞類型進行作圖，旨在獲得它們的基因表達數(shù)據(jù)。她說：“腫瘤內(nèi)不同細胞群體產(chǎn)生的復(fù)雜景觀，成為了精確診斷的障礙。”由于對腫瘤部分取樣進行的測序不能捕獲其全部圖像，進而丟失了癌癥－細胞群體的異質(zhì)性，進一步影響到患者的預(yù)后和他們對不同治療方案的應(yīng)答。

2012年袁開發(fā)了一款軟件，對取自300個乳腺癌組織活檢全腫瘤載玻片的大約100萬個細胞逐一進行分類，然后與其他“組學”數(shù)據(jù)進行集成（由100個計算芯片組成的計算機簇完成這項工作）。通過與其他腫瘤數(shù)據(jù)比對（該軟件輸出的是數(shù)據(jù)，不是圖像），袁發(fā)現(xiàn)，那些免疫細胞滲入腫瘤的患者有更好的預(yù)后。當圖像數(shù)據(jù)與基因表達數(shù)據(jù)連接時，這種預(yù)測得到了增強。當病理學家凝視基因表達數(shù)據(jù)清單時，這種結(jié)果并不明顯，但當該軟件分析圖像時，就變得清晰了。目前，袁計劃著將她的這項研究擴展到卵巢癌和肺癌中。

 

 數(shù)字式圖像分析使病理學家工作變得輕松的同時，也催生新的硬件類型的產(chǎn)生，而制作數(shù)字式顯微鏡圖像，則意味著需要較為昂貴的掃描顯微鏡鏡片。目前，研究人員正在開發(fā)既掃描迅速又相對便宜的顯微鏡，旨在更多地提升軟件功能、較少依靠透鏡或其他硬件。

在傳統(tǒng)顯微鏡中，低倍透鏡是犧牲分辨率得到寬視野，而高分辨率則只能看到小的視野。在帕薩迪納加州理工學院從事顯微鏡技術(shù)研發(fā)的楊長輝（Changhuei Yang，音譯）說：“機械掃描相對緩慢。”他的解決方案是增加傳統(tǒng)顯微鏡的視野和分辨率。2013年7月，楊長輝將一架低分辨率光學顯微鏡改裝成一架高分辨率顯微鏡，進而可以用便宜的硬件制作全玻片圖像——在0.8毫米的分辨率下觀察到120平方毫米的面積。而標準顯微鏡在這個分辨率下只能提供1.1平方毫米的視野。  

更進一步的是，加州大學洛杉磯分校的電子工程師埃道甘·奧茲坎（Aydogan Ozcan）正在研發(fā)一款無透鏡的顯微鏡，擅長處理生物學“濕件”樣品，能夠完成物理透鏡所做的同樣事情：將模糊的干涉模式轉(zhuǎn)換成細胞的聚焦圖像。在細節(jié)上，其致密顯微鏡與透鏡顯微鏡完全一樣，擁有數(shù)百納米分辨率，可以清晰地顯示細胞核。

與此同時，奧茲坎還在嘗試眾包他的診斷學儀器——將顯微鏡制作的血液細胞圖像上傳到一個連線游戲上（一個非專業(yè)人士認識感染瘧疾的細胞的教學游戲），供眾多游戲迷游戲，然后對答案做統(tǒng)計學綜合。結(jié)果，這款游戲產(chǎn)生與病理學家相同診斷的次數(shù)比例達99%。奧茲坎認為，這款智能軟件最終能從病理學家那里接管部分事務(wù)。

亞里桑那州鳳凰城視覺門公司首席執(zhí)行官艾倫·納爾遜（Alan Nelson）認為，計算創(chuàng)新將會給病理學領(lǐng)域帶來改變。目前，他正在研發(fā)針對血液中癌細胞三維成像的自動化檢測系統(tǒng)。他說：“機器不會給出意見，它能產(chǎn)生的是數(shù)據(jù)和基于統(tǒng)計學的診斷。”該系統(tǒng)有望增加篩查速率，幫助病人更快地得到治療。

納爾遜曾是目前市場上唯一的自動化癌癥篩查儀的首席發(fā)明人，其NeoPath公司研發(fā)的宮頸癌檢測儀，在1996年獲得美國食品和藥品管理局（FDA）的批準——這款檢測儀是專門為測定宮頸帕氏涂片內(nèi)癌細胞而定制，載有數(shù)百片載玻片，可以終日進行自動化掃描。

當今的計算機已今非昔比。納爾遜稱，在軟件的輔助下，顯微鏡可以向生物學家和醫(yī)生展示以前他們從沒看到的事物：奧茲坎的無透鏡顯微鏡已經(jīng)向人們展示了精子螺旋運動的新模式，視覺門公司的三維圖像可以向病理學家展示數(shù)百種以前無法看到的特征結(jié)構(gòu)。“我們可以清晰地看到肺癌細胞核內(nèi)的表面紋理，或測量出六號染色體短臂的長度，我的上帝呀，真是太美了！”