超高分辨率熒光顯微鏡的應(yīng)用前景

 1、 光學(xué)顯微鏡的出現(xiàn)及其影響自荷蘭博物學(xué)家、顯微鏡創(chuàng)制者Antonie van Leeuwenhoek(1632-1723)在17世紀第一次將光線通過透鏡聚焦制成光學(xué)顯微鏡并用它觀察微生物(microorganisms or animalcule)以來，顯微鏡就一直是生物學(xué)家從事研究工作、探尋生命奧秘必不可少的利器。正是因為有了Leeuwenhoek的這項偉大發(fā)明及其后繼者對顯微鏡技術(shù)的不斷改進和發(fā)展，人們才能夠?qū)毎麅?nèi)部錯綜復(fù)雜的亞細胞器等結(jié)構(gòu)的形態(tài)有了初步的了解。

    此后，研究人員對顯微鏡技術(shù)的追求從未停歇過，他們總是希望能得到分辨率更高的顯微鏡，從而更好地觀察細胞內(nèi) 部更細微的結(jié)構(gòu)。最近，《自然-方法》(Nature Methods)雜志上報道的超高分辨率成像技術(shù)(super-resolution imaging, SR imaging)終于使得人們可以在單分子水平上進行觀察研究。

科信儀器熒光顯微鏡：http://m.610876.cn/search-141-0.shtml

2 、SR技術(shù)的發(fā)展過程

    在達到今天SR技術(shù)水平的過程中，承載了許許多多研究人員辛勤勞動的汗水，也面臨著諸多亟待解決的難題。

    在以上這些光學(xué)SR成像技術(shù)中有兩種技術(shù)——受激發(fā)射減損顯微鏡(stimulated emission depletion microscopy, STED)和飽和結(jié)構(gòu)光學(xué)顯微鏡(saturated structured illumination microscopy，SSIM)最受關(guān)注。

    最近，基于探針SR成像技術(shù)的光敏定位顯微鏡(PALM)和隨機光學(xué)重建顯微鏡(STORM)，以及借助熒光基團隨機激活特性的熒光光敏定位顯微鏡(FPALM)都已經(jīng)取得了成功。

    通過基于探針的SR成像技術(shù)，可以獲得多張原始圖像。在每一張原始圖像中，細胞內(nèi)只有一部分被熒光標記的分子能發(fā)出熒光，即這些熒光分子都處于不斷激活和滅活的交替狀態(tài)，每一次都只有部分分子能被觀察并成像。而且由于每次發(fā)出熒光的分子都分散得較為稀疏，因此相互之間不會受到影響，也就避免了因相鄰分子發(fā)出熒光而無法分辨的問題。最后將這些原始圖片疊加、重合在一起就得到了最終的高分辨率圖像。這樣，就能使得那些以前由于熒光點太密以至于無法成像的結(jié)構(gòu)的分辨率達到納米級水平，而且成像的分子密度也相當(dāng)高，可以達到105個分子/μm2。

    這種分辨率對于生物學(xué)家來說，意味著現(xiàn)在可以在分子水平上觀察細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)及其動態(tài)過程了。

    雖然顯微鏡技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到了如此高度，但它仍然只是生物學(xué)家研究中使用的一種工具。因此還需要將顯微鏡獲得的圖像與其它的試驗結(jié)果互相參照，才能獲得準確的結(jié)果。人們需要認清SR顯微鏡的優(yōu)勢與劣勢，為操作以及判斷SR圖像制定出標準化的操作規(guī)范，只有這樣才能最大限度地發(fā)揮SR顯微鏡的作用。

    現(xiàn)在，由于人們對細胞內(nèi)各組份的組織結(jié)構(gòu)以及它們的動態(tài)變化過程都只有一個概念上的認識，因此，借助顯微鏡從納米水平上對這些結(jié)構(gòu)及過程進行真實的觀察能讓人們發(fā)現(xiàn)許多以往所不了解的東西。例如，以前人們通過電鏡發(fā)現(xiàn)細胞骨架是由大量絲狀網(wǎng)格樣組織構(gòu)成時，就有人對此現(xiàn)象持懷疑態(tài)度。那些認為細胞骨架是一種用來稀釋細胞內(nèi)生化物質(zhì)濃湯這樣一種結(jié)構(gòu)的細胞生物學(xué)家把這種觀測結(jié)果稱作僵化的人為試驗結(jié)果。

    除非最新的SR顯微鏡圖像或者其它的試驗結(jié)果都能證明細胞骨架是由大量的絲狀網(wǎng)格樣組織構(gòu)成的，否則還會有人持上述的懷疑觀點。不過已經(jīng)有其它的生化試驗結(jié)果證實了早期的電鏡觀察結(jié)果是正確的。當(dāng)然新興的SR技術(shù)也需要其它傳統(tǒng)的生化試驗結(jié)果予以佐證才有價值，同時還需要電鏡的輔助。因為電鏡能提供納米級的觀察結(jié)果，這對于佐證具有同樣分辨率的SR顯微鏡觀測結(jié)果來說是最有價值的。

    今后，大家在逐步了解、接受和廣泛使用SR顯微鏡的同時，需要注意將會出現(xiàn)的各種問題，以下的表格列出了部分與SR顯微鏡使用相關(guān)的缺點及其目前的解決方法。

    最近幾年，就如何處理圖像已經(jīng)有了非常嚴格的操作規(guī)范。不過迄今為止，對于怎么處理SR圖像還沒有一個標準的操作規(guī)范。尤其需要指出的是，PALM和STORM數(shù)據(jù)在某些重要因素上，graph方面的共性要多于image方面。在一張SR圖像上，分子的不確定性和密度都能用顏色表示出來，這種圖像把細胞內(nèi)該分子有可能出現(xiàn)的任何地點都標示出來了。而且只有被標記的分子按照一定的標準(發(fā)出的光子數(shù))判斷它的確是一個單分子并且定位準確之后才顯示出來。必須對獲得的圖像進行這樣的標準化處理之后才能分析結(jié)果。同樣，對于試驗數(shù)據(jù)也需要如此進行標準化處理。要提高分辨率不僅需要分子定位、分布得比較好，還需要分子數(shù)目夠多，以致能達到尼奎斯特判斷法(Nyquist criterion)的要求，即分子間的平均距離要小于顯微鏡分辨率的一半。雖然上述問題都不會影響SR顯微鏡的應(yīng)用，但由于存在這些問題，所以我們應(yīng)該時刻提醒自己，一定要仔細判讀、分析SR顯微鏡的圖像結(jié)果，只有這樣才能得到有價值的生物學(xué)結(jié)論。

3、 SR熒光顯微鏡在生物學(xué)研究中的應(yīng)用

     到目前為止，人們還很難得知，SR熒光顯微鏡會對生物學(xué)界的哪一個領(lǐng)域帶來重大變革，但已經(jīng)有幾個領(lǐng)域出現(xiàn)了明顯的改變。這些研究領(lǐng)域是動態(tài)及靜態(tài)的細胞組織結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域、非均質(zhì)分子組織研究領(lǐng)域、蛋白動態(tài)組裝研究領(lǐng)域等。這幾個領(lǐng)域都有一個共同的特點，那就是它們研究的重點都是分子間如何相互作用、組裝形成復(fù)合物。因此，能在納米水平觀察這些分子對它們來說具有重大的意義。

1、通過觀察蛋白質(zhì)之間的組合關(guān)系來了解它們的作用，并能為后續(xù)的細胞功能試驗打下基礎(chǔ)

     結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究在這方面已經(jīng)取得了很大的進展，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4-8納米大小的分子間相互作用組裝成細胞微管、肌絲、中間絲這些超過10微米大小聚合物的機制。不過對于核孔復(fù)合體、中心體、著絲點、中間體、粘著斑這些由許多不同蛋白經(jīng)過復(fù)雜的三維組裝方式組合起來的復(fù)合體，還需要更好的辦法來進行研究。目標就是要達到分子水平的分辨率，這樣就可以觀察大復(fù)合體形成過程中的單個分子，也就能對這些分子的化學(xué)計量學(xué)有所了解了。要得到更多的生物學(xué)信息就需要SR顯微鏡這樣的三維成像技術(shù)，例如可以使用活體細胞SR成像捕捉細胞骨架的動態(tài)重構(gòu)過程等等。

2、 SR成像有助于人們更好地了解分子間的差異

     細胞膜蛋白組織方式的經(jīng)典模型已經(jīng)從隨機分布的液態(tài)鑲嵌模型轉(zhuǎn)變成了脂筏模型、穴樣內(nèi)陷模型或特殊蛋白模型。這種差異與細胞不同功能相關(guān)，例如在高爾基體、cargo蛋白和高爾基體酶蛋白之間必須發(fā)生相互作用，但最終它們會按照各自的功能分開，發(fā)揮各自的作用。有很多試驗手段，例如免疫電鏡技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)等都已經(jīng)被用來研究這種膜不均一性問題了。多色PALM技術(shù)(Multicolor PALM)為人們提供了一種新的手段用來觀察膜蛋白集合、組織的過程，并且還能定量分析不同蛋白間的空間距離關(guān)系。因為有了PALM提供的單分子信息，人們就可以清楚地了解蛋白分子間的空間關(guān)系，甚至有可能計算出相隔某一距離的分子之間發(fā)生相互作用的可能性。這種方法除了用于研究膜蛋白之外，還能用于許多非隨機分布的生物系統(tǒng)研究，例如研究微管上的馬達蛋白。

3、 SR成像技術(shù)還能用于在單分子水平研究蛋白動態(tài)組裝過程

    細胞對外界刺激信號的反應(yīng)起始于胞膜，在胞膜上受體蛋白之間發(fā)生動態(tài)的集合，用來調(diào)節(jié)細胞的反應(yīng)活性。像HIV這種有被膜病毒也是在細胞膜上完成病毒顆粒組裝過程的病毒，也是利用了細胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)運機制。盡管現(xiàn)在蛋白組裝的物理模型還遠遠沒有完成，但研究人員知道膜蛋白的動態(tài)組裝過程是不均一的，所以通常使用熒光試驗手段很難獲得分子水平上的信息。同樣，單分子測量技術(shù)(Single molecule measurements)也存在著類似的局限，因為單分子測量技術(shù)只能觀察細胞內(nèi)的幾個分子，所以缺乏整體的信息。因此由于缺乏空間分辨率，很難動態(tài)地研究蛋白質(zhì)組裝過程。SR熒光成像技術(shù)與活細胞成像技術(shù)和單分子示蹤技術(shù)(sptPALM)結(jié)合就能解決這一問題。我們可以借助分子密度準確地看出PALM圖像中的蛋白質(zhì)簇，蛋白質(zhì)簇動態(tài)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)和形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)能幫助我們了解蛋白質(zhì)動態(tài)組裝的機制。

    上面只是選了生物學(xué)研究中的3個方面來說明SR技術(shù)的用途，但這已經(jīng)很好的展示了我們是如何從Leeuwenhoek最初對于生命組成的假設(shè)一步一步走到了今天，使用SR顯微鏡來證實構(gòu)成生命體的最基本材料——分子的組合過程。STED和PALM的商業(yè)化產(chǎn)品已經(jīng)上市了，這標志著SR顯微鏡的時代來臨了。我們相信SR顯微鏡在充滿創(chuàng)造力的生物學(xué)家們手中，一定會充分發(fā)揮它的作用，幫助我們發(fā)現(xiàn)更多生命的奧秘。

三 可誘導(dǎo)多潛能干細胞技術(shù)新進展

    近幾年，將體細胞重編程為多潛能干細胞的技術(shù)已經(jīng)有了很大的改進和提高?？梢灶A(yù)見，將來這些技術(shù)還會得到進一步的發(fā)展。現(xiàn)在，關(guān)于這方面的生物學(xué)研究不斷涌現(xiàn)。

    早在一年前，人們就將可誘導(dǎo)多潛能干細胞(induced pluri-potent (iPS) stem cells)技術(shù)作為一個值得關(guān)注的研究領(lǐng)域進行了相關(guān)報道。但直到最近，該技術(shù)(在體細胞中表達幾種轉(zhuǎn)錄因子即可將體細胞重編程為iPS細胞)才能成功應(yīng)用于人體體細胞。

    該技術(shù)體系的用途之廣泛是顯而易見的。例如，可以用于研究人體早期發(fā)育過程、構(gòu)建疾病模型或應(yīng)用于臨床治療等等。然而該技術(shù)還是存在幾個亟待解決的問題。

    值得高興的是，目前已經(jīng)有多個實驗室在iPS技術(shù)的以下幾個方面取得了進展。有的實驗室能對更多種類的體細胞進行重編程;有的實驗室能使用小分子而非轉(zhuǎn)錄因子成功重編程體細胞;還有的實驗室操作過程中使用的轉(zhuǎn)錄因子比以往少幾種，但重編程效率卻較之以往提高了100倍?，F(xiàn)在，篩選哪些轉(zhuǎn)錄因子或小分子物質(zhì)，對于重編程來說是必須的研究，而且還在進行之中。

    最近有報道稱，在小鼠體細胞內(nèi)瞬時表達重編程因子也能成功獲得iPS細胞。這就避免了使用病毒載體轉(zhuǎn)染細胞表達轉(zhuǎn)錄因子這種傳統(tǒng)方法可能造成的病毒整合入細胞基因組等問題的發(fā)生。

    除了繼續(xù)追求技術(shù)上的進步之外，科學(xué)家還將從基因表達、表觀遺傳學(xué)、細胞分化等各個方面深入研究iPS細胞本身的生物學(xué)問題，這些方面都將影響到iPS細胞將來的應(yīng)用，并且我們堅信這將是未來iPS細胞研究領(lǐng)域發(fā)展的新方向。

四 人造生命

    在人們成功合成人造基因組之后，下一步就該是發(fā)揮這些基因的功能了。

    合成生物學(xué)(見文后小詞典)最主要的長期目標之一就是使用最小的、非冗余的基因組構(gòu)建一個具有某種功能的活體生命。而短期內(nèi)亟待解決的問題則是，如何使用未經(jīng)加工的化學(xué)原料組裝一個完整的基因組以及非必需基因(nonessential genes)等。

    2008年，研究人員終于在基因組組裝問題上取得了突破性進展。J. Craig Venter等人使用體外重組技術(shù)(in vitrorecombination strategy)將一段長約24Kb的寡聚核苷酸鏈和另一段更長的核苷酸鏈重組，然后將該重組體轉(zhuǎn)入酵母細胞中，最終獲得了長達582.9Kb的生殖支原體(Mycoplasma genitalium)基因組。Mitsuhiro Itaya等人則使用體內(nèi)重組技術(shù)(in vivo recombination strategy)在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)內(nèi)將一系列長約4~6Kb的多米諾骨牌樣克隆(domino clones)組裝在一起，獲得了長約134.5Kb的水稻線粒體(rice chloroplasts)基因組。

    接下來的工作就是檢驗這些人造基因組是否具有相應(yīng)功能了。Venter等人已經(jīng)成功將絲狀支原體(M. mycoides)的基因組植入了山羊支原體(M. capricolum)細胞中，現(xiàn)在，他們準備將人工合成的生殖支原體基因組移植入山羊支原體細胞中，不過這一試驗在技術(shù)上還是存在一定的難度，因為它并不能像將絲狀支原體的基因組植入山羊支原體細胞中那么容易。而且人造基因組是否能在酵母細胞中正確組裝，而不被胞內(nèi)限制性核酸酶消化，并復(fù)制、編碼形成一個活的細菌(支原體)還需要試驗來進一步驗證。另一個需要解決的問題就是如何優(yōu)化密碼子。人造基因組對于其宿主細胞來說是不能有毒性的。然而，一個完整的基因組必須被植入受體細胞中并且要能夠表達出它自己編碼的功能蛋白。

    毫無疑問，這種人造生命技術(shù)與其它的新技術(shù)一樣，肯定會引起眾多的爭議，甚至恐慌，但它對于了解生命，對于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的進步來說也的確會起到不可估量的作用。

五 圖像自動識別系統(tǒng)

    借助圖像自動識別系統(tǒng)(Automated imaging)，人們能對顯微鏡下的圖像進行定量分析，并拓展顯微鏡的用途。

    自從顯微鏡誕生以來，它就一直是科學(xué)家進行科學(xué)研究的得力助手。不過，顯微鏡圖像一直只能算是一個描述性的結(jié)果，不能進行定量分析，而且進行顯微鏡觀察是一項非常費時、費力的工作，這些缺陷一直阻礙著顯微鏡的廣泛應(yīng)用。

    當(dāng)Antonie van Leeuwenhoek在15世紀60年代第一次使用他自制的顯微鏡觀察到微生物的時候，當(dāng)Santiago Ramón y Cajal在200多年前第一次觀察到神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的時候，他們都已經(jīng)花費了很長的時間來進行觀察工作，同時還需要花費很長時間將鏡下的一切描繪到紙上。今天，科學(xué)家使用比當(dāng)年先進得多的顯微鏡以及電荷耦合照相機(CCD camera)就能馬上獲得比當(dāng)年清晰得多的圖像，但是對于大多數(shù)的生物學(xué)家來說，他們使用顯微鏡還是只能通過大量的鏡下觀察來得到一個描述性的圖像結(jié)果而已。

    不過現(xiàn)在，借助計算機技術(shù)以及各種復(fù)雜的算法，顯微鏡可以有更多、更大的作為了。如今，已經(jīng)發(fā)展到使用計算機來控制顯微鏡進行大部分的圖像采集工作，顯微鏡下的圖像結(jié)果不僅僅是描述性的，還可以通過計算機的運算對圖像結(jié)果進行定量分析。這一切進步都是以往單單使用肉眼進行觀察所無法比擬的。

    即使對于那些目前還不能進行自動化分析的項目，例如在體內(nèi)或體外試驗中分析大量細胞中的基因表達水平，如果能夠進行自動化分析，也將大大提高檢測的效率和定量分析的準確度。

    自動圖像采集技術(shù)需要一系列相關(guān)技術(shù)協(xié)同作用才能成功。例如，需要使用合適的算法、需要選擇合適的結(jié)果分析方式等等。雖然這些技術(shù)正在逐漸被大家所了解和使用，但目前還只是剛剛開始，還不成熟，還需要進一步的改進，才能滿足更多科研人員的實際需要。對于自動圖像采集技術(shù)的新老用戶來說，在使用的時候都要小心仔細地進行操作和分析，不過相比該技術(shù)所可能帶來的令人激動的成果而言，這樣的謹慎還是相當(dāng)值得的。

六 定量質(zhì)譜檢測技術(shù)

    現(xiàn)在，大量使用基于定量質(zhì)譜檢測技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法來研究生物問題正變得越來越常見了。

    使用質(zhì)譜技術(shù)來檢測蛋白質(zhì)已經(jīng)成為了一種常規(guī)方法，并且正越來越多地應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究當(dāng)中。但是要真正了解復(fù)雜生物體的生物學(xué)情況，還需要有關(guān)蛋白質(zhì)表達水平方面的資料。不幸的是，傳統(tǒng)的質(zhì)譜檢測技術(shù)還不具備定量的能力。

    因此，在過去的10年間，從事蛋白質(zhì)組學(xué)研究的科研工作者發(fā)明了一系列的穩(wěn)定同位素標記策略(stable-isotope labeling strategy)，希望藉此獲取定量信息。

    同時，檢測設(shè)備和生物信息學(xué)方面最近取得的進展也使得定量質(zhì)譜檢測技術(shù)成為了可能。僅就去年一年，就有好幾項值得人們注意的蛋白質(zhì)組學(xué)研究成果發(fā)表，尤其值得關(guān)注的是使用由Matthias Mann小組在2002年發(fā)明的細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素氨基酸標記技術(shù)(stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC)這類代謝標記技術(shù)(metabolic labeling techniques)獲得的研究成果。2008年，Mann小組和其他科研人員發(fā)現(xiàn)，只需使用少量標記物，就可以對整只小鼠進行同位素標記，對細胞周期內(nèi)的磷酸化動力學(xué)情況進行研究，了解miRNA對蛋白質(zhì)組的影響效果，以及比較單倍體酵母和雙倍體酵母的蛋白質(zhì)組學(xué)情況等等。

    不過，要對蛋白質(zhì)水平進行絕對的定量，只能通過往已消化的蛋白質(zhì)組樣品中摻入已知數(shù)量的人工合成同位素標記肽段才能獲得，這一方法是由Steven Gygi小組在2003年首先提出的。不過，在得到能代表所有蛋白質(zhì)的同位素標記的水解肽段(isotope-labeled proteotypic peptides，這些肽段最有可能被質(zhì)譜儀連續(xù)捕捉到)以前，要想得到蛋白質(zhì)組的整體絕對定量數(shù)據(jù)是根本不可能的。

    研究人員希望，在不久的將來能更好地運用同位素代謝標記的方法來進行研究，幫助人們使用質(zhì)譜檢測技術(shù)從蛋白質(zhì)組學(xué)的層面。

七 膜蛋白結(jié)構(gòu)解析技術(shù)新進展

    蛋白表達、溶解和結(jié)晶這一系列技術(shù)瓶頸的突破，使得研究膜蛋白的原子結(jié)構(gòu)成為可能。

    細胞中有大約30%的蛋白質(zhì)是膜蛋白，不過人們現(xiàn)在還不是很清楚這些膜蛋白的原子結(jié)構(gòu)。到目前為止，在PDB(Protein Data Bank)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中只有不到1%的資料是膜蛋白的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。這不是說膜蛋白的結(jié)構(gòu)不重要，相反，膜受體蛋白非常重要，它們是大部分藥物的作用靶點。但由于一直缺乏很好的膜蛋白大量可溶性表達技術(shù)，因此也就得不到足夠的蛋白結(jié)晶體用于結(jié)構(gòu)分析。即使是結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(文后小詞典)這項旨在分析每一個蛋白家族結(jié)構(gòu)的學(xué)科，也因為存在技術(shù)難題而沒有將研究重點放在膜蛋白上。

    現(xiàn)在，經(jīng)過傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)生物學(xué)家和結(jié)構(gòu)基因組學(xué)家的不懈努力，蛋白表達、溶解和結(jié)晶這一系列的技術(shù)瓶頸都得到了突破，并且已經(jīng)出現(xiàn)了部分成果。

2007年和2008年，學(xué)術(shù)界接連發(fā)表了好幾篇具有里程碑意義的文章，這幾篇文章都是有關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體(G protein–coupled receptor, GPCR)結(jié)晶體結(jié)構(gòu)這一傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)學(xué)難題方面的論文。

    諸如美國紐約膜蛋白結(jié)構(gòu)協(xié)會(New York Consortium on Membrane Protein Structures, NYCOMPS)和膜蛋白結(jié)構(gòu)中心(Center for Structures of Membrane Proteins, CSMP)這樣的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究組織和其他的幾家國際性研究組織正在攜手共同努力制定一個高效的、規(guī)范化的技術(shù)流程來研究膜蛋白結(jié)構(gòu)。到目前為止，已經(jīng)得到了幾個膜蛋白的結(jié)構(gòu)資料。與此同時，不需要使用蛋白結(jié)晶體來研究結(jié)構(gòu)的固態(tài)核磁共振(solid-state NMR)技術(shù)也得到了飛速發(fā)展，不過該技術(shù)在敏感度和分辨率方面還需要進行進一步的改進。

    現(xiàn)在還不太可能得到一個“通用的、萬能的”技術(shù)流程來分析所有的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，因此還需要開發(fā)出其它一些針對不同蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的研究方法。我們相信，未來幾年會出現(xiàn)更多的研究膜蛋白結(jié)構(gòu)的方法，在PDB中也會找到更多膜蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。

八 光學(xué)顯微鏡觀察較厚樣品不再是難題

    隨著對較厚樣品光學(xué)成像能力的增強，使用光學(xué)成像技術(shù)來觀察活體內(nèi)的生物過程正逐漸成為可能。

    生物體都是三維結(jié)構(gòu)的，即使活體狀態(tài)下的細胞也很少會像它們在培養(yǎng)皿中那樣呈現(xiàn)出單獨的單層狀態(tài)。不過，在進行活體研究時歷來就存在技術(shù)困難，尤其是在活體成像技術(shù)方面更是沒有什么突破。

    生物組織大部分都是不透光的，而且對光的散射能力特別強，因此，觀察較厚組織時很難獲得質(zhì)量較好的圖像。例如，使用傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡就無法觀察厚度超過數(shù)百微米的樣品，但果蠅幼蟲(fruitfly larva)、哺乳動物的胚胎(mammalian embryo)或者組織切片等樣品的厚度通常都要遠遠超過這個范圍。另一方面，研究人員也希望能獲得這些樣品的整體圖像，從而能對這些樣品的組織結(jié)構(gòu)和基因表達情況有個整體了解，不過這些要求對于傳統(tǒng)的光學(xué)成像技術(shù)來說都難以達到。盡管現(xiàn)在有了核磁共振成像技術(shù)(magnetic resonance Imaging，MRI)，在觀察的深度方面有了一定的提高，但圖像的分辨率還遠遠達不到要求。

    因此，在類似共聚焦顯微鏡(confocal microscopy)這類高分辨率的成像技術(shù)和能進行活體觀察但分辨率較低的成像技術(shù)(如MRI)之間就出現(xiàn)了一道分水嶺。不過，最近幾年間出現(xiàn)的幾種新的光學(xué)成像技術(shù)有望消除這道鴻溝。

    單層光顯微技術(shù)(light sheet microscopy)這項最近獲得改進的傳統(tǒng)技術(shù)能對厚達數(shù)毫米的樣品進行觀察，并能進行熒光成像。該技術(shù)已經(jīng)成功用于觀察細小生物體和胚胎組織。去年，有科研工作者使用改進的單層光顯微技術(shù)觀察斑馬魚胚胎在24小時內(nèi)的發(fā)育狀況，并獲得了數(shù)千個細胞的整體圖像。

    相比之下,諸如光學(xué)投影層析成像技術(shù)(optical projection tomography，OPT)這類層析成象技術(shù)就需要先對樣品進行多角度觀察，然后再使用數(shù)字技術(shù)重建，才能獲得三維圖像。OPT可以對厚度達到10毫米的樣品進行成像。去年，有人將OPT技術(shù)和體外器官培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合起來，獲得了發(fā)育中的小鼠肢芽(limb bud)組織遷移以及基因表達情況的圖像。

    雖然上述三維成像技術(shù)和其它的一些三維成像技術(shù)還沒有被大眾廣泛接受，但人們相信，隨著這些技術(shù)的不斷改進，隨著大家對這些技術(shù)的不斷了解，它們很快就會得到廣泛應(yīng)用的。

九 試驗驗證miRNA靶基因

    盡管現(xiàn)在人們可以越來越準確地預(yù)測microRNA的沉默效果，但還是需要高通量而且準確的直接驗證技術(shù)來驗證microRNA的沉默效果。

    microRNA這個在生物科學(xué)史上具有重要意義的小分子，在2008年又一次成為了世人矚目的焦點。microRNA通過與目標mRNA的3’UTR區(qū)域結(jié)合來阻止其翻譯，具體作用機制可分為兩種：一種是降解目標mRNA從而達到阻止其翻譯的目的，另一種則是直接抑制mRNA的翻譯過程。

    為了了解細胞中基因的真正生物學(xué)意義，研究人員往往會使用很多microRNA分子來沉默細胞中大量的mRNA表達，有時候這些被沉默基因的數(shù)目甚至比所使用的microRNA數(shù)目還要多。而現(xiàn)在使用的計算機預(yù)測靶基因技術(shù)還不夠成熟，非常容易出錯。鑒于此，去年人們開始使用一種新型的大規(guī)模驗證方法，即在硅片上進行microRNA靶基因驗證的“濕試驗(真正的試驗而不是用計算機模擬的“干”試驗)”。

    由于采用了這種方法，研究人員在2008年取得了一系列的成果。Nikolaus Rajewsky小組和David Bartel小組都各自獨立地將蛋白質(zhì)組學(xué)與分子生物技術(shù)結(jié)合在一起，使用定量質(zhì)譜檢測技術(shù)檢測了細胞里蛋白質(zhì)組水平的蛋白表達變化情況，然后將這些蛋白表達的改變情況與特定microRNA分子的多少聯(lián)系起來進行分析，以此來驗證microRNA的靶基因沉默效果。因為microRNA作用的結(jié)果就是導(dǎo)致某些蛋白表達量的減少，因此在蛋白質(zhì)組水平上進行定量的檢測是應(yīng)該可以檢測到這些蛋白表達量下降的。因此，使用該技術(shù)從理論上說是能夠準確判斷microRNA分子是否能夠有效沉默靶基因的。

    另一種從整體水平上來檢測microRNA靶基因沉默效果的辦法就是降解組測序法(degradome sequencing)(降解組，見文后小詞典)。Pamela Green小組和Michael Axtell小組曾經(jīng)在植物研究中使用過這一種新方法。在研究microRNA靶基因沉默效果時科研人員對microRNA介導(dǎo)的mRNA降解產(chǎn)物進行了測序，然后再使用這些被測出的序列與microRNA數(shù)據(jù)庫進行比對就能發(fā)現(xiàn)是哪些microRNA分子導(dǎo)致了這一種mRNA分子降解。這一技術(shù)在植物microRNA研究中應(yīng)用得非常成功，能非常準確地預(yù)測出microRNA針對的靶基因。不過，在其它以前還未能很好進行預(yù)測的物種中，這種方法的準確率有多高還需要進一步的實驗加以驗證。

    與此同時，生物信息學(xué)家還在不斷豐富他們的數(shù)據(jù)庫，希望用更多的數(shù)據(jù)加以比對，從而提高計算機預(yù)測的準確率。其中的一種比對方法就是mirWIP方法。該方法由Victor Ambros小組設(shè)計，他們使用的是已經(jīng)經(jīng)過免疫沉淀技術(shù)驗證過的秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)microRNA數(shù)據(jù)庫及其相應(yīng)靶mRNA數(shù)據(jù)庫，希望這樣能夠提高計算機預(yù)測的準確率。

    上述整體水平檢測方法都極大提高了人們預(yù)測microRNA靶基因的準確率，也為人們進行下一步的試驗驗證工作提供了更準確的候選microRNA分子，不過最終還是需要高通量的“濕試驗”來進行驗證確認。

十 光調(diào)控細胞功能——新的研究方向

    現(xiàn)在，人們不僅可以用光來觀察細胞活動，還可以用光來控制細胞活動，這方面的研究正在興起之中。

2005年，Georg Nagel實驗室和Karl Deisseroth實驗室的聯(lián)合研究證實，光激活細菌(信號轉(zhuǎn)導(dǎo))通路channelrhodopsin-2(ChR2)能活化神經(jīng)信號(轉(zhuǎn)導(dǎo))。由于該過程簡單易操作，激發(fā)了神經(jīng)科學(xué)家的極大興趣。

   Negel實驗室還展示了光活化的腺苷酸環(huán)化酶，并把這個技術(shù)延伸到新的信號(轉(zhuǎn)導(dǎo))通路領(lǐng)域。

   另外一個研究小組通過在神經(jīng)元表達ChR2并且用光線照射細胞，可以隨意使神經(jīng)元去極化，并精確控制該神經(jīng)信號(轉(zhuǎn)導(dǎo))基礎(chǔ)下的示蹤行為。

    2007年，該研究小組在早期研究基礎(chǔ)上做出改進，指出一個新的光敏通道可以使細胞超級化從而抑制神經(jīng)信號。他們成功地在體內(nèi)并聯(lián)使用兩個通道去激發(fā)和抑制神經(jīng)信號(轉(zhuǎn)導(dǎo))。

    2008年，光調(diào)控細胞技術(shù)更是得到了長足的發(fā)展。我們有理由相信，在未來的幾年中，該技術(shù)一定會成為研究的熱點。

    現(xiàn)在，越來越多的研究人員了解到在神經(jīng)刺激過程中ChR2的作用。已有實驗證明，在大腦切片組織中，或體內(nèi)研究中，ChR2是最適合進行神經(jīng)通路研究的，并且現(xiàn)在人們已經(jīng)將ChR2的使用范圍擴展到了行為學(xué)研究。

   研究人員可以通過遺傳學(xué)手段使小鼠大腦驅(qū)體感覺皮層(somatosensory cortex)細胞中表達ChR2。例如，可以用光訓(xùn)練這種小鼠，然后研究表達有ChR2的神經(jīng)元細胞對短暫的光刺激產(chǎn)生的動作電位(action potential)有何變化?；蛘呖梢允褂冒唏R魚做實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，光照可以引起大腦軀體感覺神經(jīng)元(somatosensory neuron)的一次動作電位，繼而引起魚的躲避反應(yīng)。

   盡管，如果要將ChR2應(yīng)用到臨床還需要有很長的一段路要走，但研究人員還是取得了一定的進展。他們在大鼠脊髓損傷后，將ChR2轉(zhuǎn)導(dǎo)入大鼠脊髓神經(jīng)元細胞之中，然后再進行光照刺激，結(jié)果恢復(fù)了大鼠的呼吸功能。同樣，在視網(wǎng)膜變性的動物視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞中表達ChR2，也能恢復(fù)其視敏感度。事實上，去年光控技術(shù)領(lǐng)域的研究不僅僅限于對ChR2的研究，其它的光相關(guān)技術(shù)也有不同程度的進展。例如，光定位生物樣品中目標區(qū)域的速度及靈活性方面就有了明顯的提高，因此，也就改進了通過光照來釋放細胞中生物活性物質(zhì)的技術(shù)。此外，也出現(xiàn)了許多新的光激活物質(zhì)可供生物學(xué)家使用。這些新產(chǎn)品不僅僅包括傳統(tǒng)的小分子可被激活物質(zhì)，還包括一系列光敏感的可以對蛋白質(zhì)進行遺傳改造的產(chǎn)品。盡管光“控”細胞技術(shù)永遠也不可能取代光“照”細胞技術(shù)的地位，但光“控”細胞技術(shù)一定會越來越強大，顯示出它自身的實力的。

         來源：丁香園http://www.biomart.cn/experiment/628/629/58166.htm

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